PI3K/Akt信号通路与天然免疫限制性因子SAMHD1在PRRSV感染过程中的作用研究

【摘要】猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）感染引起一种急性、高度传染的病毒性传染病，对世界养猪业造成巨大的经济损失。2006年，我国出现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV），加大了对养猪业的危害。目前，病毒仍在持续的进化，在世界范围内受到广泛关注。PRRSV难以控制的原因之一在于病毒的致病和免疫机理并不十分清楚，因此，难以研发安全、有效的疫苗来对该病进行防控。病毒侵入机体后，机体对侵入的病毒产生一定的限制和清除作用。病毒如何调控细胞内相关信号通路或利用自身编码蛋白来逃避机体免疫系统的识别和清除，从而有利于自身的感染和复制，成为近年来针对PRRSV研究的热点。PI3K/Akt信号通路是细胞内重要的信号转导通路，多种病毒感染过程中均能够活化该通路来有利于自身的复制和增殖。SAMHD1作为最新发现的天然免疫限制性因子，具有三磷酸水解酶的活性，能够降解细胞内dNTP，阻止I型人免疫缺陷病毒（HIV-1）的逆转录过程，抑制病毒在髓系细胞中的感染与复制。作为猪肺泡巨噬细胞（PAM）嗜性的PRRSV，感染过程中是否需要PI3K/Akt信号通路参与以及与SAMHD1的蛋白相互作用机制如何，这些都是针对PRRSV病毒感染亟待研究的问题。本研究发现，HP-PRRSVHuN4株感染过程能够激活PI3K/Akt信号通路促进自身的感染与增殖。病毒在感染过程中活化PI3K/Akt信号通路具有细胞特异性，活化的PI3K/Akt与病毒的感染增殖无关，而与病毒诱导的细胞病变的形成密切相关。HP-PRRSV感染通过Akt下游FoxO1和Bad通路来促进细胞的存活，下游的GSK-3信号分子与病毒感染增殖密切相关。HuN4-F112病毒在GSK-3抑制剂持续存在的条件下进行传代，结果发现在连续传代14代后，病毒滴度可恢复到与未添加抑制剂的对照组一致的水平。对抑制剂耐受的PRRSV突变株进行全基因测序和序列对比发现，抑制剂耐受病毒基因组中共有18个核苷酸发生突变，其中Nsp2、Nsp12、GP3和GP4蛋白中6个核苷酸的突变可导致病毒氨基酸的突变，暗示这6个氨基酸可能在病毒复制过程中，单独或相互协调对GSK-3信号通路进行调节。为了探索SAMHD1对HP-PRRSV增殖的影响，本实验通过RACE方法克隆获得猪SAMHD1全基因及其编码序列。原核表达纯化重组猪SAMHD1蛋白，并以此为免疫原制备了具有特异性反应的猪SAMHD1单克隆抗体。对SAMHD1的遗传进化、亚细胞定位和组织分布分析发现，SAMHD1具有严格的分支界限且是一种核内定位蛋白，猪SAMHD1几乎在所有组织中均有表达，但在扁桃体、淋巴结、肺脏、肝脏中出现高表达。在MARC-145细胞中过表达SAMHD1，westernblot分析和间接免疫荧光（IFA）实验发现，HuN4的感染和增殖受到显著抑制，细胞培养上清中病毒滴度明显降低。蛋白磷酸化分析发现，过表达SAMHD1主要以非磷酸化的形式存在。实时荧光定量RT-PCR检测发现，过表达SAMHD1能够明显抑制病毒基因组cRNA链的合成，并且能够显著上调ISG15和ISG56的转录水平。因此，我们推测SAMHD1能够发挥其三磷酸水解酶的活性以及调控干扰素相关因子的表达拮抗HuN4病毒的感染增殖。SAMHD1表达调控机制研究发现，TLR3和RIG-I/MDA5通路参与SAMHD1表达。干扰素调节因子3（IRF-3）的磷酸化入核在调控SAMHD1的表达方面具有重要作用。实验发现，IFN-α能够诱导PAM和MARC-145细胞中SAMHD1上调表达。过表达TBK1上调SAMHD1的表达和启动子的荧光素酶活性，将其磷酸化功能性位点Ser172突变后，其诱导SAMHD1表达和启动子荧光素酶活性的能力降低。过表达IRF-3上调SAMHD1启动子的荧光素酶活性，但只有活化形式的IRF-3能够上调SAMHD1的表达。干扰IRF-3表达后，IFN-α诱导SAMHD1上调表达受到显著抑制；恢复IRF-3的表达，SAMHD1的诱导表达又恢复到与对照组一致的水平。抑制IRF-3磷酸化入核后，IFN-α和NDV感染均无法诱导SAMHD1的上调表达。HuN4感染调控SAMHD1的机制研究发现，HuN4感染MARC-145细胞中IRF-3的磷酸化受到显著抑制，同时SAMHD1的表达并未出现明显变化，在感染后期出现了一定程度的下降。而HuN4感染PAM细胞时，能够显著上调IRF-3的磷酸化活性和SAMHD1的表达。通过对IRF-3上游相关通路的活化分析发现，HuN4感染主要通过RIG-I/MDA5/TBK1通路激活IRF-3并上调SAMHD1的表达。PAM细胞中抑制IRF-3的磷酸化入核，HuN4感染诱导的SAMHD1表达受到显著抑制，但HuN4的增殖在感染早期出现了显著增加。可见，SAMHD1在拮抗HuN4病毒在PAM细胞中的增殖具有一定的作用。对SAMHD1磷酸化分析发现，HuN4感染MARC-145细胞过程中，SAMHD1一直处于磷酸化的状态，而PAM细胞中SAMHD1并没有出现磷酸化。免疫沉淀实验发现，MARC-145细胞中，CyclinA2/CDK1复合体能够与SAMHD1互作，促进SAMHD1的磷酸化。HuN4感染能够上调CDK1的活性；抑制CyclinA2/CDK1复合体的活性，HuN4病毒的增殖受到了显著抑制。MARC-145细胞中下调SAMHD1的表达，HuN4病毒的增殖并没有增加。以上结果表明，HuN4感染过程中，能够通过抑制IRF-3的磷酸化和促进CyclinA2/CDK1的活性，来抑制SAMHD1的表达和功能，促进自身的增殖。总之，本研究证实激活PI3K/Akt信号通路与HP-PRRSV感染密切相关，天然免疫限制性因子SAMHD1能够拮抗HP-PRRSV的感染并且病毒感染过程能够调控SAMHD1活性来促进自身的感染，这些研究结果对于进一步揭示病毒的感染机理以及进一步进行抗PRRSV研究具有积极的意义。
【作者】杨莘；
【导师】童光志；
【作者基本信息】中国农业科学院，预防兽医学，2014，博士
【关键词】猪繁殖与呼吸综合征病毒；PI3K/Akt；SAMHD1；IRF-3；

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